Isabella komt vlak voor de dood van Filips II in het bezit van de Nederlanden, dat als bruidsschat door haar vader wordt gegeven aan Isabelle en haar echtgenoot. Daar woedt dan al enkele tientallen jaren een

Albrecht en Isabella door P.P. Rubens

opstandingsoorlog tussen de vooral protestante Noordelijke gewesten en de vooral katholieke gewesten in het zuiden gesteund door Spanje. De Noordelijke Nederlanden erkennen het bewind van Isabella en haar echtgenoot niet. Isabelle en Albrecht nemen hun intrek in Brussel.

In de Zuidelijke Nederlanden raken Albrecht van Oostenrijk en Isabella geliefd bij de bevolking, ondanks dat ze godsdienstvrijheid en vrijhandel verbieden. In 1611 voeren ze het Eeuwig Edict in: hierin worden de familienamen vastgelegd en worden kerken verplicht doop-, huwelijk- en overlijdensregisters aan te leggen. Hier maken eeuwen later geneologen dankbaar gebruik van.

Ook slagen Albrecht en Isabella erin met de Noordelijke opstandelingen een bestand te sluiten, waardoor de vijandigheden 12 jaar gestaakt worden (zie Twaalfjarig Bestand).

Als in 1621 Albrecht van Oostenrijk overlijdt, komen de Zuidelijke Nederlanden weer onder direct Spaans bestuur. Koning Filips III wordt de nieuwe vorst. Isabella wil terug naar Spanje, naar het klooster van de Descalzas. Dit wordt haar niet toegestaan en ze blijft tegen haar zin in Brussel als landvoogdes. In deze functie probeert ze in 1633 buiten de vorst om vredesbesprekingen met de Noordelijke opstandelingen in gang te zetten. Dit mislukt en Isabelle overlijdt kort erna.